Тренажер как собрать: Страница не найдена (404)

Тренировочный симулятор сборки военной техники

McCurdy’s Armor ™ используются сегодня во многих странах мира, включая США, Ирак, Афганистан, Иорданию, Абу-Даби и Мексику. При надлежащем обучении, что является важным требованием, DDM в партнерстве с ForgeFX разработала этот интерактивный 3D-симулятор, который обучает военнослужащих, как быстро собрать систему брони.Симуляторы военной подготовки помогают солдатам оставаться хорошо обученными и безопасными во всем мире.

Тренажер для обучения оборудованию на основе имитационного моделирования

Программное обеспечение для пользовательского 3D-моделирования в реальном времени

McCurdy’s Armor Assembly Trainer — это специально разработанный пакет программного обеспечения для трехмерного моделирования в реальном времени, который обеспечивает виртуальное практическое обучение и инструкции по настройке стен и ограждений. Программа представляет собой загружаемое настольное приложение для Windows, разработанное с помощью Microsoft XNA Framework.XNA — это среда программирования и набор управляемых библиотек на основе Microsoft.NET Framework, которая позволяет разработчикам использовать Visual Studio для создания игр, которые запускаются на компьютерах под управлением Windows, а также на консоли Xbox 360 и Windows Phone. Пользователи могут свободно перемещаться по виртуальной трехмерной среде, где они могут создавать конфигурации армированных стен и конструкций. В комплекте с учебным пособием, которое обучает операторов тому, как использовать тренажер, приложение позволяет пользователям внимательно изучать детали каждого этапа сборки или наблюдать за автоматической сборкой конструкции в ускоренном режиме.

Тренировочное моделирование 3D-оборудования

Обучение на основе моделирования

бронепанелей удерживаются на месте путем скручивания ручку замка на внешней стороне брони, который входит в зацепление внутренний засов. Панели брони снабжены приваренными подъемными ручками. Это интерактивное 3D-моделирование позволяет солдатам познакомиться с несколькими частями, которые требуются для каждой конструкции, и с тем, как они прикрепляются друг к другу, чтобы они могли выполнять свою работу быстрее, безопаснее и эффективнее на поле боя, где каждая секунда на счету .

Тренировочный симулятор военной техники

В честь павшего капрала морской пехоты Райана МакКарди

McCurdy’s Armor ™ назван в честь павшего младшего капрала морской пехоты Райана МакКерди, погибшего в бою в Фаллудже, Ирак, 5 января 2006 года. Младший капрал Райан Маккарди, служивший в Фаллудже вместе со специалистом по продукции DDM Джо Даймондом, был настоящим героем, который проиграл его жизнь, когда он вытаскивал раненого капрала Клифтона Троттера в безопасное место. DDM считает, что если бы у Райана был такой продукт, как их портативная система бронированных стен, он бы пережил нападение, унесшее его жизнь в тот день.ForgeFX гордится тем, что сотрудничает с Dynamic Defense Materials в разработке этого симулятора военной техники, и надеется, что обучение, которое он предоставляет, поможет быстрее избавить солдат от опасности.

Обучение на основе моделирования

Виртуальная трехмерная учебная среда

Тренажер McCurdy’s Armor ™ Assembly Trainer предоставляет виртуальную среду, которая позволяет солдатам непосредственно испытать, отработать и освоить процесс сборки постов охраны. Пользователи могут перемещаться по виртуальной трехмерной среде в реальном времени, используя общие элементы управления видеоиграми, что позволяет операторам строить конструкции и проверять их, ходя вокруг, приседая, увеличивая масштаб и т. Д.Начиная с рамы в свернутом положении, пользователи оттягивают защелку, чтобы развернуть раму. Когда рама разложена, две боковые ворота можно открыть и заблокировать с помощью четырех переключателей ворот. Постепенно солдаты становятся участниками строительства различных типов структур, непосредственно наблюдая за тем, как работает система брони, и перенося эту мышечную память с собой в реальный мир.

Тренажер для оборудования

McCurdy’s Armor Virtual Assembly Instructions Image Showcase

Коллекция скриншотов и изображений инструктора по виртуальной сборке McCurdy’s Armor.

Если вам поручено обучать людей сборке критически важного оборудования, вы знаете о проблемах, связанных с проведением обучения на реальном оборудовании. Интерактивные тренажеры 3D-обучения позволяют предоставить операторам безопасное и экономичное решение для обучения. Для оценки потребностей, характерных для вашего проекта, свяжитесь с нами, чтобы мы могли рассмотреть ваши требования и предложить план проекта, включая рекомендации по технологиям.

NERDSS: неравновесный симулятор самосборки множества тел в клеточном масштабе

Введение

Наблюдение за динамикой отдельных молекул в клетке, когда они функционируют как часть коллектива, теперь возможно благодаря революциям в микроскопии живых клеток .Компьютерное моделирование обещает воспроизвести эту динамику с использованием моделей, разработанных на основе лежащих в основе физики и механики, обеспечивая пространственные и временные предсказания с высоким разрешением и точный контроль над компонентами и их взаимодействиями. Современные инструменты для определения сложности клеточного масштаба становятся все более популярным спутником клеточной биологии. Например, в области передачи сигналов клетки выиграли от множества пространственных ^{1, 2} и непространственных инструментов ^{3, 4} , где взаимодействия и реакции моделируются как события, параметризованные константами скорости.Однако многие процессы на уровне клетки включают самосборку — проблема для моделирования, потому что она охватывает такую ​​же большую длину и масштабы времени, что и сигнальные каскады, а также фундаментально зависит от геометрии молекулярной структуры. Инструменты на основе скорости были применены к самосборке, но не имеют пространственного разрешения ^{3, 5} , применяются только к очень маленьким системам ^{6, 7} или включают потенциалы, которые препятствуют количественному сравнению с экспериментом ⁸ . Здесь мы представляем имитатор самосборки неравновесной реакции-диффузии (NERDSS), программный инструмент с более высоким разрешением, основанный на скорости, с добавлением определяемой пользователем грубой молекулярной структуры, позволяющей изучать самосборку в клеточном масштабе. .

NERDSS был разработан для встраивания самосборки в модель реакции-диффузии (RD) из-за силы RD в моделировании относительно медленной, неравновесной клеточной динамики. Продолжительность и временные масштабы такой динамики затруднены или невозможны с альтернативным и стандартным вычислительным подходом для самосборки крупнозернистых моделей молекулярной динамики (МД) ^9–11 . Для этих моделей взаимодействия возникают из-за зависимых от расстояния энергетических функций, а не из-за событий, контролируемых скоростью, поэтому, хотя они более физически реалистичны, им не хватает систематических и переносимых методов для вовлечения ферментативных или управляемых АТФ реакций, повсеместно распространенных в клетках.Они неспособны имитировать передачу сигналов in vivo клеток , динамику цитоскелета или, например, клатрин-опосредованный эндоцитоз. Наше программное обеспечение NERDSS устраняет этот существенный пробел в применении, и, хотя ему не хватает деталей моделей, основанных на энергетических функциях, оно способно уникальным образом сохранить важные особенности сборки молекул.

NERDSS преодолевает несколько технических проблем, добавляя структуру к RD и позволяя формировать большие обратимые комплексы удобным для пользователя и расширяемым способом.Чтобы выйти за рамки одночастичного RD ^12–15 , белки здесь могут иметь несколько сайтов взаимодействия в определенных координатах, а для достижения больших размеров системы мы используем алгоритм перевыборки Free-Propagator Reweighting ¹² с последними расширениями для включения и учета для вращательной и поступательной диффузии ¹⁶ . Чтобы поддерживать точные решения уравнений движения RD и прямое сравнение с экспериментальными скоростями, связывающая ассоциация между белками может происходить при столкновении и не зависит от их относительной ориентации ¹⁶ .Вместо этого связанные белки ориентируются в соответствии с заданной пользователем геометрией после возникновения событий ассоциации, которые могут быть разработаны с помощью нашего графического интерфейса. Это также сохраняет гибкость и адаптируемость метода к новым молекулам и структурам, поскольку связывание параметризуется скоростями, а не потенциалами взаимодействия. NERDSS сохраняет детальный баланс для связывания и расцепления между отдельными видами или между белками, совместно локализованными через ряд общих партнеров по связыванию, тем самым обеспечивая термодинамическое равновесие для обратимых систем, как на мембране, так и за ее пределами ^{17, 18} .Таким образом, даже большие сборки могут распадаться спонтанно, или с помощью NERDSS диссоциация может катализироваться дополнительными реакциями. Реализация реакций на основе правил ¹⁹ означает, что пользователи могут выбирать, добавлять или удалять кооперативность, ферментативные реакции или условность для связывающих взаимодействий, предоставляя инструмент для исследования широкого диапазона механизмов сборки.

Здесь мы применяем NERDSS для моделирования сборки вирионов, динамики экспрессии белков и клатрин-опосредованного эндоцитоза (CME), уделяя особое внимание последнему.Эти примеры подчеркивают несколько проблем и возможностей для моделирования подходов. CME — важный путь, используемый всеми эукариотами для транспорта через плазматическую мембрану. Таким образом, доступно множество биохимических данных ²⁰ , структурных ²¹ и in vivo изображений ^22–24 , но прогнозирование поглощения груза CME остается чрезвычайно трудным из-за сложности пути. CME — это случайный процесс, который зависит от мембранной механики, ферментативных реакций и стехиометрии десятков различных компонентов.Клатрин, тримерный белок 600 кДа, собирается как в плоскую, так и в сферическую решетку in vivo, и , in vitro, , хотя in vivo, , этот процесс происходит только на плазматической мембране, при этом требуется множество дополнительных и адаптерных белков. поскольку сам клатрин не связывает мембрану. Существующие симуляции сборки клатрин-клетка обеспечивают важное физическое понимание CME, но они используют специальные модели, основанные на энергии, которые требуют значительного опыта для разработки ^{11,25, 26} или не имеют пространственного разрешения ^{27, 28} .Здесь мы реализуем расширяемую многокомпонентную модель сборки клатриновой решетки для количественной оценки различных путей и динамики сборки в растворе и на мембране и непосредственно воспроизводим эксперименты по флуоресценции ²⁹ . Наше моделирование также показывает, насколько эффективно мембрана может регулировать сборку просто за счет уменьшения размерности (с 3D на 2D) ¹⁸ . С помощью NERDSS мы можем предсказать, как дефосфорилирование основных липидов плазматической мембраны, которое происходит в местах отрастания пузырьков ²² , может дестабилизировать структуры, покрытые клатрином, и управлять их разборкой.

Таким образом, NERDSS предлагает отличный инструмент, который использует модель реакции-диффузии для имитации самосборки в масштабе клеток, что позволяет получить динамику и кинетику, зависящие от пространства и времени, которые сразу же сопоставимы с экспериментом широкой пользовательской базы. Ниже мы сначала описываем работу программного обеспечения и функции, которые мы вводили по мере необходимости, чтобы выйти за рамки существующих инструментов (рис. 1). Затем мы представляем несколько приложений с входными файлами, предоставленными в репозитории программного обеспечения.Мы разрабатываем несколько моделей сборки клатриновой решетки, выделяя отличительные особенности моделей, которые можно использовать для настройки динамики и стабильности наблюдаемых структур. Мы оптимизируем модель клатрина непосредственно против зависящих от времени in vitro экспериментальных данных набора и сборки клатрина на мембранах ²⁹ . Мы также вводим ферменты в систему, чтобы контролировать популяцию липидов на мембране и приводить в движение разборку, фиксируя управляемую неравновесную динамику.Мы проиллюстрировали процесс проектирования модели для самосборки мономеров ретровирусного белка Gag в незрелую решетку, которая является важным компонентом ВИЧ-инфекции и цикла созревания ³⁰ . Наше добавление здесь самосборки к моделям реакции-диффузии расширяет существующий диапазон возможностей моделирования RD. Чтобы продемонстрировать использование NERDSS для решения проблем, не связанных со сборкой, мы резюмируем колебания экспрессии белка в модели циркадных часов ³¹ , с проверкой против моделирования с использованием программного обеспечения Virtual Cell ¹ .Наконец, мы обсуждаем текущие ограничения и наиболее многообещающие будущие достижения программного обеспечения NERDSS для реалистичной динамики в масштабе ячеек.

a) NERDSS требует нескольких знакомых пользовательских входных данных, включая граничные условия моделирования, определения видов и правила реакции для этих видов, написанные в синтаксисе в стиле BNGL ¹⁹ , чтобы действовать на отдельные интерфейсы или на целые молекулы. Для NERDSS дополнительные входные данные в желтых прямоугольниках — это геометрия вида, при этом каждый вид моделируется как твердое тело с координатами центра масс (красный) и его дискретных границ раздела (синий), а также ориентацией привязки.Эти параметры ориентации определяют геометрию результирующего комплекса: радиус привязки σ, показанный фиолетовой линией между двумя интерфейсами; два угла, θ ₁ и θ ₂ ; три двугранных угла: φ ₁ , φ ₂ и ω (см. дополнительную информацию). И геометрия, и ориентация могут быть разработаны с помощью графического интерфейса пользователя NERDSS. NERDSS использует алгоритмы взвешивания свободного пропагатора (FPR) для решения модели реакции-диффузии с течением времени.В дополнение к координатам всех видов в моделировании как функции времени, NERDSS может отслеживать множество переменных, включая количество копий видов (или текущее количество взаимодействий), которые записываются в файлы в формате CSV для анализа и визуализации. Траектории выводятся в одном из двух стандартных форматов, XYZ или PDB, которые можно визуализировать в программном обеспечении, таком как VMD ³² или Ovito ³³ . б) Алгоритмическая блок-схема показывает, где необходимы модификации моделей, зависящих от времени и / или пространства (серый цвет), из-за добавления молекулярной структуры (желтый).Исключенный объем применяется в небольшом подмножестве пространственных методов, отсюда и двойной цвет. Реакции могут быть 0 ^{-й порядок} : создание, 1 ^{-й порядок} : смерть, трансформации, диссоциации, 2 ^{-й порядок} : связывание, связанное состояние или два продукта. На каждом временном шаге каждая молекула либо реагирует, либо диффундирует.

Результаты

NERDSS позволяет моделировать самосборку

NERDSS сочетает в себе новейшие алгоритмы диффузии реакций с структурным разрешением ¹⁶ с моделированием на основе правил ¹⁹ , ориентируемыми компонентами и удобными инструментами для проектирования системы (рис. , чтобы создать широко обобщаемое программное обеспечение реакции-диффузии, способное моделировать самосборку.NERDSS достаточно эффективен, чтобы моделировать сборку от секунд до минут на одном процессоре (рис. S1). Проверка NERDSS выполняется путем изменения временных шагов ¹⁶ (рис. S2) и путем сравнения моделей с теорией и другими методами, основанными на скорости (рис. S3-S5). Некоторые особенности NERDSS являются новыми для одночастичных и пространственных RD (рис. 1b), включая представление молекул (таких как белки или липиды) как дискретных объектов с интерфейсами, расположенными в определенных координатах относительно центра масс молекулы.

Включение более мелкой геометрии молекулярных контактов в самосборку создает две проблемы. Во-первых, алгоритмы моделирования должны правильно моделировать вращение, диффузию и реакцию в правильной геометрии. В NERDSS молекулы могут связываться друг с другом при столкновении, подобно другим одночастичным методам RD ^12–14 , но поскольку они могут иметь трехмерную структуру, ассоциация сопровождается ориентацией молекул в связанное состояние. Наш недавно разработанный алгоритм распространяет динамику RD, которая включает как вращательную, так и поступательную диффузию ¹⁶ .Уникальной особенностью NERDSS является оценка стерического перекрытия при ассоциации. Хотя исключение объема применяется во время распространения между всеми парами интерфейсов, которые реагируют (что является общим с некоторыми другими одночастичными алгоритмами ^{12, 13} ), события ассоциации могут привести к тому, что две многокомпонентные сборки будут зафиксированы в связанном состоянии, что заставит интерфейсы перекрывать друг друга. Эти перемещения отклоняются, как и перемещения, которые создают слишком большие сборки, чтобы поместиться в объеме моделирования.NERDSS позволяет связываться между молекулами независимо от их ориентации до события, и, таким образом, некоторые реакции могут производить большие вращения для расширенных сборок: также могут быть наложены ограничения, чтобы отклонить эти движения. Во-вторых, пользователь должен иметь возможность удобно задавать геометрию самого комплекса. Связанные состояния определяются как часть модели во время настройки системы. Например, это включает размещение связывающих интерфейсов на расстоянии сайт-сайт (σ) и возможность поворота двух молекул на 5 относительных углов в заданную ориентацию.Мы предоставляем графический интерфейс для облегчения громоздкого построения этих молекул и связанных состояний.

Это информация для сравнения NERDSS с NFSim ³ , которая не имеет пространственного разрешения, но моделирует модели на основе скорости, которые могут формировать мультибелковые сборки с помощью многоузловых видов и моделирования на основе правил (рис. S3-S4). Подобно NFSim и другим непространственным методам, основанным на скорости, NERDSS использует моделирование на основе правил для определения реакций, включающих целые виды, определенные интерфейсы или определенные состояния интерфейсов (например.грамм. фосфорилированный или нефосфорилированный). Моделирование на основе правил исключает необходимость определения и отслеживания всех возможных видов и позволяет избежать проблемы комбинаторной сложности ³⁴ . Формат на основе правил вполне естественно транслируется в NERDSS из-за пространственной спецификации каждого интерфейса, чего нельзя сказать о других методах одночастичного RD. Благодаря структурному разрешению NERDSS фиксирует несколько элементов самосборки, невозможных с помощью NFsim, включая геометрию и топологию решетки, а также схемы их роста.

В отличие от непространственных и пространственных методов, NERDSS определяет, когда связывающие интерфейсы локализованы в одном и том же комплексе (как, например, при формировании клатриновой решетки), и использует пространственные ограничения для оценки возможности связывания. Эти внутрикомплексные реакции замыкания петли являются фактически мономолекулярными, поскольку компоненты больше не диффундируют в пространстве относительно друг друга, и скорости определяются с использованием формулы для сохранения барьеров свободной энергии парных скоростей компонентов (методы).Благодаря своему пространственному разрешению NERDSS также естественным образом подстраивается под изменения скорости реакции из-за ограничения одного или обоих компонентов на 2D-поверхности (методы). Эти реакции точно решаются с использованием алгоритмов FPR ^{12, 16, 17} и предназначены для сохранения детального баланса для обратимых взаимодействий связывания (если явно не определены скорости, нарушающие это). Наконец, как и для любого пространственного метода, NERDSS должен определять граничные условия для объема моделирования. В то время как все процедуры NERDSS работают в пределах простого прямоугольного объема и (при необходимости) плоской мембраны, программное обеспечение также обрабатывает произвольно изогнутые поверхности ³⁵ .Эта новая функция для одночастичного RD ³⁶ также включает эффективный метод поверхностного связывания с использованием неявной липидной модели. Неявная липидная модель точно воспроизводит кинетику связывания из более дорогостоящих явных липидных симуляций с ускорением на порядки ³⁶ .

NERDSS количественно оценивает

Мощным аспектом NERDSS является способность создавать микроскопические модели, результаты которых можно напрямую сравнивать с экспериментами по многокомпонентной сборке.Недавние эксперименты in vitro измерили кинетику локализации клатрина на мембранах, покрытых адаптерным белком ²⁹ . Мы инициализируем моделирование, чтобы соответствовать эксперименту, с адаптерными белками, связанными с поверхностью мембраны, и относительно разбавленным (80 нМ), но большим объемом раствора клатрина, который превышает площадь поверхности мембраны (рис. 2). В нашей модели клатрин имеет три сайта для связывания других молекул клатрина и три сайта для связывания адаптерных белков, таким образом локализуя молекулу на 2D-поверхности.

a) Моделирование имитировало экспериментальные условия из недавно опубликованной работы Holkar et al. ²⁹ , в которой флуоресценция клатрина на мембранных канальцах измерялась во времени. Постоянная (колеблющаяся) концентрация раствора клатрина (80 нМ) поддерживалась посредством обмена с резервуаром большого объема. б) Данные флуоресценции, усредненные по множеству канальцев, показаны красным.Лучший результат модели показан черным пунктиром. По оси ординат отложены копии клатрина на мембране, на 1 мкм ² , где данные флуоресценции можно масштабировать, поскольку они имеют произвольные единицы. Несмотря на произвольные единицы флуоресценции, как наблюдаемые временные масштабы, так и известная геометрия / концентрации эксперимента сильно ограничивали модели. Лишь небольшая часть моделей может воспроизвести медленное отставание (10 с) экспериментальной кинетики, за которым следует относительно быстрое зарождение решетки на поверхности, которое замедляется из-за потери доступной площади поверхности и сайтов связывания адаптеров (методы).Снимки вдоль траектории показывают, как зарождаются несколько отдельных участков, которые в конечном итоге вырастают радиально наружу, покрывая поверхность. Каждый клатрин содержит центр масс и три участка связывания «ножек» на расстоянии 8 нм от центра, так что связанная пара имеет центры, разделенные на 17 нм. Три сайта связывания адаптеров смещены от плоской поверхности взаимодействия с клатрином. Здесь не учитываются эффекты кривизны. Копии адаптера были инициализированы уже связанными с поверхностью при 0,007 / нм ² (методы).

Простейшая модель, которую мы создали, которая может воспроизвести наблюдаемую экспериментальную кинетику (рис. 2), имеет два источника кооперативности. Во-первых, как только клатрин связывает адаптерные белки, его сродство к другим клатринам увеличивается, экспериментально хорошо установленный феномен ³⁷ . Во-вторых, как только клатрин локализуется на поверхности, он связывает дополнительные адаптеры или клатрины с 2D константой скорости ¹⁸ . Оба источника кооперативности способствуют относительно быстрому зарождению и стабилизации на поверхности после начальной задержки из-за медленного связывания клатрина с адаптерами.Насыщение клатрином на поверхности происходит в результате потери доступной площади поверхности и участков связывания адаптеров. Аффинности связывания, которые мы указываем между белками, сопоставимы с литературными измерениями (собраны здесь ¹⁸ ) (полные сведения см. В разделе «Методы»). Мы используем здесь плоские тримеры клатрина, потому что мембрана моделируется как плоская поверхность, которая в настоящее время не претерпевает никакой динамики. Плоские клатриновые решетки действительно образуют in vitro и in vivo ^{38, 39} , подтверждая, что по крайней мере некоторые сборки отсоединены от ремоделирования мембраны ⁴⁰ .Изгиб мембраны может создать дополнительный источник кооперативности, если клатрины способствуют высокой кривизне, а также вызывают ее, что является активным будущим направлением для этого программного обеспечения.

NERDSS тестирует сборку клатриновой клетки, разработанную с помощью четырех различных моделей взаимодействий клатрин-клатрин

Сборку клатрина в растворе экспериментально наблюдают либо при низком pH, либо в присутствии адаптерных белков концевого связывания клатрина ^{37, 41} . Мы моделируем различные условия сборки, изменяя силу связывания, кооперативность и геометрию связывания растворов, содержащих только клатрин, в отличие от того, как несколько наблюдаемых изменяются с различными параметризациями модели.Во все системы мы включаем 100 трискелий клатрина, причем каждый клатрин содержит центр масс и три участка связывания «ножек» с поворотом на 120 градусов друг от друга и на расстоянии 10 нм от центра, так что связанная пара имеет центры, разделенные на 21 нм. Базовая модель имеет K _D для связывания ноги и ноги 100 мк M, что сопоставимо с экспериментальными оценками димеризации тримеров ⁴² . В растворе при этой концентрации наблюдается очень небольшое связывание (рис. 3a), что согласуется с исследованиями in vitro клатрина в растворе при физиологическом pH ⁴¹ .Те же результаты наблюдаются при непространственном моделировании (рис. S3).

a ₁ ) Для K _D = 100 мкМ большая часть клатрина остается мономерной в растворе. a ₂ ) Подсчет пар связанных ветвей тримера клатрина. а ₃ ) Гистограмма, показывающая общее количество копий трискелии клатрина в виде распределенных комплексов увеличивающегося размера. Во всех симуляциях есть 100 тримеров. б) Увеличив K _D до 0.2 мкМ, образуются большие плоские решетки. c) За счет введения кооперативности, при которой связывание мономерного клатрина с немономерным сильнее в 10 раз, а от немономерного к немономерного снова в 10 раз сильнее, решетки могут образовываться, несмотря на слабый мономерный K _D = 100 мкМ. d) Изменяя геометрию мономеров клатрина, но сохраняя тот же K _D = 0,2 мкМ из (b), они собираются в сферические клетки с аналогичной кинетикой связывания, но образуют более мелкие комплексы (d ₃ относительно b _3). ).Результаты усредняются по 3-5 траекториям, а фильмы SI генерируются с помощью VMD.

При простом усилении K _D до 0,2 мкМ плоские клатриновые решетки собираются довольно быстро (k _от = 1 с ^-1 ), и через 100 с они превращаются в стабильные гигантские компоненты (рис. 3b). Дополнительный параметр привязки разрешен для всех моделей, которые могут привести к замыканию петли (здесь, шестиугольные петли). Этот параметр действует как мера положительной или отрицательной кооперативности из-за образования двух одновременных интерфейсов в замкнутом контуре и определяет относительную стабильность замкнутых и открытых контуров (методы SI).Таким образом, это может изменить окончательное равновесие для данной димеризации K _D , способствуя меньшему количеству связей и большему ремоделированию (Рис. S3-S4).

Вместо того, чтобы вводить кооперативность в связывании между клатринами, так что скорость зависит от того, связан ли уже мономер с другим клатрином, плоские решетки собираются после задержки с последующим быстрым ростом (Рис. 3c). Таким образом, эта модель имеет три скорости связывания клатрин-клатрин, причем наиболее сильное связывание происходит между клатринами, которые уже связаны с другими.Эта модель роста приводит к более широкому распределению размеров решетки (рис. 3c ₃ ). (Фильм S1)

Взяв модель на рис. 3b (K _D = 0,2 мкм) и изменив геометрию мономера клатрина, чтобы наклонить ноги на 10 градусов ниже плоскости, образуются сферические клетки (фильм S2). Кинетика связывания нога-нога остается очень похожей на фиг. 3b ₂ , но размеры комплексов меньше из-за пространственных ограничений замкнутых сфер и пространственного перекрытия (фиг. 3d ₃ ).В этой модели проявляются две важные алгоритмические особенности из-за жесткой структуры тримера клатрина и его сборки в сфероид. Во-первых, поскольку решетка не может идеально формироваться на сфере, дефекты появляются даже внутри одного замкнутого шестиугольника. Биомолекулы обычно обладают гибкостью, чтобы изгибаться и образовывать контакты, поддерживая распределение структурной геометрии, поэтому мы позволяем сайтам внутри комплекса связываться друг с другом, даже если они не находятся в идеальном контакте (методы). Эти связи важны, потому что они стабилизируют комплекс от диссоциации, даже если они не изменяют жесткую структуру комплекса.Во-вторых, при наличии дефектов в решетке оценка стерического перекрытия при ассоциации сложнее, поскольку мономеры могут перекрываться, но сами сайты связывания смещены друг от друга (методы).

NERDSS проверяет сборку решетки, управляемую локализацией на мембране

Повышение концентрации компонентов — еще один естественный механизм сборки зародышей. На рис. 4 мы показываем, как локализация на поверхности двумерной мембраны может сама по себе образовывать зародыши клатриновых решеток за счет увеличения эффективной концентрации клатрина по сравнению с трехмерным раствором (фильм S3).Как и на рис. 2, клатрин может быть локализован на поверхности адаптерным белком, но здесь адаптер начинается в растворе. Адаптер содержит как мотив взаимодействия с белками для связывания концевой области клатрина, так и липид-связывающий домен, который обычно нацелен на фосфатидилинозитолбисфосфат, PI (4,5) P ₂ , что составляет ~ 1 мол.% Липидов PM. Взаимодействие клатрин-клатрин здесь установлено на слабое значение 100 мк M (рис. 3a), и, таким образом, минимальное связывание происходит в растворе.Однако, как только клатрин локализован на поверхности, они могут собираться в решетку, которая стабилизируется относительно слабыми клатрин-клатриновыми контактами, но, тем не менее, является благоприятной из-за небольшого пространства поиска, доступного на 2D-поверхности. Здесь не учитывается взаимодействие из-за привязки адаптера.

a) В эту модель включены три мультивалентных протеина раствора (клатрин, AP-2, синаптоянин) и один мембранный липид (PI (4,5) P ₂ ).Для этой модели клатрин не собирается в растворе, даже если он связан с белком AP-2 (аналогично рис. 3а). Только после локализации на 2D-поверхности клатрин становится достаточно концентрированным, чтобы сформировать решетку. б) Клатрин содержит три сайта для связывания другого клатрина и три отдельных сайта для связывания с AP-2. Белок AP-2 имеет специальный сайт для каждого из трех других компонентов, управляющих кластеризацией на мембране. Синаптоянинфосфатаза имеет сайт для AP-2 и независимый сайт, нацеленный на PI (4,5) P ₂ .Важно то, что белок AP-2 не взаимодействует с PI (4) P, который образуется путем связывания синаптоянина с PI (4,5) P ₂ . c) При отсутствии ферментативной активности сборка переходит в устойчивое состояние равновесия (красные кривые). При включенной активности фосфатазы большая часть липидов конвертируется за 1 секунду, за исключением популяции, которая уже связана с AP-2. Таким образом, решетка клатрина успевает собраться, но постепенно дестабилизируется, что определяется скоростью разрыва связи между адаптером и липидом, а также адаптером и клатрином, которая увеличивается с 1 с ^-1 до 10 с ^-1 между голубым и синим.

Ферменты могут управлять разборкой решетки, удаляя связи с мембраной.

Удаляя связи между клатрином и мембраной, мы можем загнать клатриновый узел обратно в раствор, в котором наша клатриновая решетка больше не стабильна. Физиологически это достигается путем изменения состояния фосфорилирования липида PI (4,5) P ₂ , который необходим для локализации адаптерных белков и, следовательно, клатрина на мембране. Таким образом, не изменяя напрямую клатрин или адаптерные белки, мы можем управлять разборкой решетки.Мы включаем сюда 10 копий липидной фосфатазы (например, синаптоянин), которая необратимо превращает PI (4,5) P ₂ в PI (4) P. Адаптерный белок не может связываться с PI (4) P, тем самым удаляя его связь с поверхностью. Важно отметить, что синаптоянин фосфатазы может быть локализован в сайтах покрытых клатрином структур in vivo посредством взаимодействия белка с адаптерным белком AP-2, что позволяет ему действовать в 2D, чтобы быстро дефосфорилировать несвязанный PI (4,5) P ₂ . Хотя in vivo , как было показано, играет важную роль в дефосфорилировании PI (4,5) P ₂ после деления от мембраны ²² , мы демонстрируем здесь, как он способен управлять разборкой связанных плазматической мембраной решетки, покрытые клатрином, по крайней мере, в этой модели in vitro типа .

Мы обнаружили, что временные рамки разборки решетки чувствительны к кинетике связывания и разрыва всех взаимодействий белок-белок и белок-липид (рис. 4). В частности, хотя фосфатазы быстро дефосфорилируют несвязанный PI (4,5) P ₂ , адаптерные белки защищают подмножество липидов, с которыми они связаны, и их связи разрываются в масштабе времени, который определяется несвязыванием. адапторно-липидных взаимодействий. Поскольку клатрин может связывать до 3-х адаптерных белков, его диссоциация от мембраны также зависит от диссоциации всех 3-х адаптеров с поверхности.Хотя эта модель не полностью параметризована для воспроизведения эксперимента (как на рис. 2), она показывает, как локализация, ферментативная активность и кинетика связывания могут быть настроены для управления сборкой и разборкой.

Построение модели требует ориентации для каждой реакции попарного связывания: приложение к вирусной сборке в растворе

Чтобы проиллюстрировать процесс создания модели, мы рассматриваем здесь мономер Gag, ретровирусный белок, который димеризуется сам с собой и олигомеризуется в гексагональную решетку в плазме. мембрана инфицированных клеток с образованием так называемого незрелого вириона ³⁰ .Gag можно грубо представить как линейный белок, который мы определяем через сайт гомодимеризации H, расположенный близко к центру масс, и два различных сайта олигомера G1 и G2, которые определяют ширину молекулы и связываются друг с другом. Чтобы сформировать решетку гексамеров из этих мономеров, достаточно двух различных типов димеров с относительной ориентацией, определяемой пятью отдельными углами для каждого димера (рис. 5).

Каждому мономеру белка Gag дается 3 активных сайта связывания и 2 неактивных сайта связывания, расположенных относительно центра масс (COM) красным цветом.Синий сайт предназначен для гомодимеризации, H, а зеленый (G1) и оранжевый (G2) сайты предназначены для гетеродимеризации с образованием гексамеров. Положение сайтов выбрано так, чтобы в результате были собраны структуры с надлежащим разделением между белковыми центрами. Ориентация связанного гомодимера определяется 5 углами и включает небольшой наклон одного мономера относительно другого для обеспечения образования сфероидной решетки. Эти 5 углов основаны на COM для интерфейсных векторов (бирюзовые линии), сигма-векторе (фиолетовая линия) и двух нормалей молекул (черные векторы), которые не должны быть коллинеарными с интерфейсными векторами, чтобы обеспечить дополнительное измерение.Ориентация связанного гетеродимера аналогично требует определения 5 углов, и G1 должен связывать G2 в цис-ориентации, чтобы гарантировать образование петли гексамера (вставка). б) Траектории показывают титрование мономеров Gag при 3,3 10 ^-5 М / с и 6,6 10 ^-5 М / с. c) Количество мономеров вначале быстро растет, но достигает относительного устойчивого состояния из-за сборки и разложения, которое происходит со скоростью 1 с ^-1 . Собранные белки защищены от деградации, вызывая постоянный рост размеров собранных комплексов.

Чтобы проиллюстрировать функциональность NERDSS, мы инициализируем объем нулевыми мономерами Gag. Затем мы титруем их, используя реакцию нулевого порядка, где они случайным образом размещаются в объеме моделирования. Таким образом, концентрация медленно увеличивается, способствуя более медленному зарождению и росту Gag в более стабильные гомодимеры и, в конечном итоге, в гексамеры (Movie S4). Мономерный кляп также деградирован, хотя собранный кляп — нет. Таким образом, долговременное поведение состоит из Gag в виде стабильных сфероидов или короткоживущих (∼1s) мономеров.Хотя известно, что гексамерные взаимодействия Gag автоматически ингибируются до связывания либо с РНК, отрицательно заряженными аналогами, либо с мембраной ³⁰ , мы здесь для простоты рассматриваем все взаимодействия как конститутивные. В соответствии с конструкцией Gag может собираться в большие сфероиды полностью за счет двух указанных реакций (рис. 5). Кинетика сборки зависит от скорости титрования, которая может иметь дополнительные ручки, помогающие оптимизировать модель по экспериментальным данным.

Повторение колебаний экспрессии белка для модели циркадных часов с использованием NERDSS

Помимо способности выполнять структурно-разрешенное моделирование самосборки, NERDSS также может моделировать другие равновесные и неравновесные явления.На рис. 6 мы смоделировали ранее разработанную минимальную модель циркадного генетического осциллятора ³¹ с помощью NERDSS, а также с помощью PDE и алгоритма стохастического моделирования (с помощью программного обеспечения Virtual Cell ¹ (SI)). Модель резюмирует, как экспрессия двух белков, белка-активатора (A) и белка-репрессора (R), может быть связана, чтобы произвести устойчивые колебания обоих белков и их связанного комплекса. Для нашей модели NERDSS, когда мРНК и белки создаются, они размещаются рядом с молекулой, создающей их.Связанный A-R комплекс аналогичным образом представлен через точки, разделенные их сигмой радиуса связывания, так что комплекс в некоторой степени виден на снимках траектории. Все скорости были увеличены в 3600 раз по сравнению с исходными из-за вычислительных затрат, так что колебания происходили в течение секунд, а не часов. Это изменение сделало диффузию событий связывания ограниченной, что означает, что они могут стать чувствительными к пространственному распределению частиц. Однако, поскольку виды смешиваются быстро, а объем не слишком велик (фильм S5), кинетика по существу нечувствительна к диффузии и пространственному измерению, количественно согласуясь как с моделированием PDE, так и с непространственным моделированием Гиллеспи той же модели ( Рис S3).

a) Модель содержит 6 компонентов, причем белки-активаторы (A) и репрессоры (R) продуцируются соответствующими мРНК, которые продуцируются одной копией каждого гена (PmrA и PrmR). Мономолекулярные реакции (кроме диссоциации) показаны реакциями, обозначенными ƞ или δ . Реакции связывания и разрыва показаны со скоростями π .б) Снимки моделирования имеют частицы, окрашенные в соответствии с частью (а). Связывание R с A дает сложный A-R (пурпурный пунктир), количество копий которого колеблется во времени, достигая пика между колебаниями количества копий A и R. Комплекс A-R расщепляется со скоростью µ , что приводит только к R, поскольку A моделируется как разлагающийся мгновенно. Период колебаний A (и R) от NERDSS находится в хорошем соответствии с непространственными и основанными на PDE симуляциями той же модели, рассчитанными как 24.5 с, 24,8 и 25,1 с соответственно (рис. S5 и SI). Из-за постоянного производства и деградации компонентов в этой модели мы использовали программное обеспечение Ovito для создания фильмов для этой модели (Movie S5) и модели Gag (Movie S4).

Обсуждение

NERDSS имеет несколько полезных функций, которые делают его мощным и незамедлительно полезным инструментом для моделирования в масштабе ячеек. Во-первых, NERDSS можно переносить между отдельными системами благодаря его структуре взаимодействия на основе скорости, которая позволяет избежать трудоемкой параметризации энергетических функций, часто жестко запрограммированной для конкретных систем сборки ¹¹ .Хотя геометрия белков и ориентация связанных комплексов в NERDSS зависят от системы, мы предоставляем графический интерфейс для облегчения пользовательского дизайна белков и их связанных состояний. Во-вторых, в отличие от существующих подходов, основанных на пространственной скорости ¹³ , встроенная молекулярная структура NERDSS не только обеспечивает исключенный объем сайтов связывания, но и оценивает, могут ли стерическое перекрытие или ограничения объема предотвращать образование нефизических структур сборки. В-третьих, он использует алгоритмы Free-Propagator Reeweighting (FPR) ^{12, 16, 17} для эффективного размножения видов, сохраняя при этом точные скорости ассоциации и диссоциации, что позволяет моделировать текущие временные шкалы от секунд до минут.NERDSS тщательно преобразует микроскопические скорости, используемые в FPR, и макроскопические скорости, обычно определяемые в эксперименте, с обширной проверкой ¹⁶ . В-четвертых, NERDSS использует синтаксис в стиле BioNetGen Language (BNGL) ⁴³ , а модели, созданные в других программных пакетах, использующие аналогичный синтаксис, могут быть перенесены в NERDSS с минимальными изменениями, что делает его доступным для немедленного использования. В этой комбинации структурного разрешения, эффективного распространения и точной обработки коэффициентов ассоциации, удобного синтаксиса входного файла и графического пользовательского интерфейса (GUI) NERDSS представляет собой уникальный инструмент для моделирования равновесной и неравновесной самосборки и других ячеек. явления.

NERDSS предназначен для расширения не только для пользователей, но и для разработчиков, расширяющих функциональность. NERDSS построен на основе алгоритмов, которые поддерживают, например, реализацию более сложных физических моделей, которые вводят электростатические взаимодействия между частицами ¹² . Текущее ограничение NERDSS состоит в том, что все виды должны быть твердыми телами, и, таким образом, дефекты сборки внутри комплекса компенсируются приблизительно с помощью допуска расстояния. Гибкость молекул — это естественное расширение за пределы жестких молекул, которое может улучшить дефекты, а также улучшить лечение неупорядоченных областей и геномов.Особенно интересным будущим развитием является интеграция NERDSS с моделями континуальных мембран ³⁶ , чтобы обеспечить более реалистичное моделирование динамики образования везикул и вирионов и связи сборки с генерацией механической силы. В конечном счете, NERDSS закодировал в качестве ключевой особенности способность разрешать относительно быстрые процессы в длительных временных масштабах и отдельные белки в больших масштабах, моделируя в противном случае неразрешимую динамику сборки белков. Это обеспечивает немедленное использование, помогая преодолеть проблемы понимания или проектирования самособирающихся структур в биологии.

Методы

Реализация

NERDSS написан в стандарте ANSI / ISO C ++ 11 и доступен для Linux и macOS. Сопутствующий графический интерфейс реализован на Java. Исходный код для обоих можно найти по адресу https://github.com/mjohn218/NERDSS и предоставляется в соответствии с общедоступной лицензией GNU (GPL). Руководство пользователя и примеры систем моделирования можно найти на странице программного обеспечения. Входные файлы отформатированы аналогично стилю BNGL, например, используемому в RuleBender ⁴⁴ и программном обеспечении NFSim ³ и совместимы с виртуальной ячейкой ¹ .Однако необходимы дополнительные функции из-за пространственных и структурных деталей, используемых в NERDSS.

Реакции

NERDSS поддерживает три основных типа реакций: нулевого, первого и второго порядка. Скорости этих реакций, кроме создания, могут зависеть от состояний и / или ранее существовавших взаимодействий интерфейсов любых участвующих видов.

Реакции нулевого порядка

De novo реакции образования частиц рассматриваются как процесс Пуассона.Никаких событий не происходит, если URN λ ), где λ = k ₀ VΔt, k ₀ — скорость в единицах М / с, V — моделирование. объем (в единицах M ⁻¹ ), а Δt — временной шаг. Следовательно, происходит N событий на основе. Созданные частицы помещаются в объем моделирования со случайными координатами. Для титрования частиц в объем моделирования можно использовать реакции нулевого порядка.

Первый порядок

Реакции первого порядка рассматриваются как процессы Пуассона с вероятностью реакции для каждой границы раздела p ₁ (Δ t ) = 1 — exp (- λ ), где λ = k ₁ Δt, k ₁ — микроскопическая скорость в единицах с ^-1 , а Δt — временной шаг.Скорости реакции могут быть указаны либо как микроскопические, либо как макроскопические скорости. Только одно такое событие может произойти на временном шаге на молекулу. Поддерживаются четыре типа реакций первого порядка:

1. Создание: создание копии частицы B из другой частицы A, где требуемые интерфейсы, такие как (a), указаны в скобках: примеры — транскрипция или перевод, например A (a) → A (a) + B (b)

2. Разрушение: уничтожить молекулу и все другие молекулы в ее комплексе.Если интерфейсы (а) указаны как несвязанные, это разрушит только несвязанные молекулы. Например. A (a) → NULL

3. Изменение состояния: изменение состояния интерфейса в молекуле, например A (a∼p) → A (a∼u)

4. Диссоциация: Устранение взаимодействия между границами раздела двух частиц, записанного как сопряженная обратная реакция реакции ассоциации. Чтобы сохранить детальный баланс, частицы оставляют так, чтобы диссоциирующие границы раздела находились на их радиусе связывания, т.е.грамм. A (a! 1) .B (b! 1) → A (a) + B (b)

Реакции второго порядка

Бимолекулярные реакции применяются к определенным границам раздела между двумя белками. Используя синтаксис BGNL, события ассоциации могут зависеть от состояния интерфейса, например происходит только тогда, когда связывающий интерфейс фосфорилируется, или только если белок также связывается через другой интерфейс.

Поскольку вероятности реакции FPR инвариантны относительно ориентации, реагирующие частицы «защелкиваются» на месте в заранее заданной геометрии, чтобы предотвратить образование произвольных структур, причем границы раздела всегда расположены на радиусе связывания σ друг от друга.Геометрия определяется набором векторов и пятью углами между и внутри каждой частицы. Если углы не определены, интерфейсы привязываются к разделению σ в той ориентации, в которой они были, когда произошло событие. Обе молекулы перемещаются и вращаются на месте в зависимости от их относительных постоянных поступательной и вращательной диффузии. Таким образом, более мелкие комплексы будут больше двигаться, чтобы ориентироваться, и комплексы, ограниченные мембраной, не поворачиваются из своей локализованной на мембране ориентации. Подробные определения этих векторов и углов можно найти во вспомогательной информации.

Скорости реакции могут быть определены либо как макроскопические скорости в единицах нм ³ / с, либо как микроскопические или собственные скорости, в единицах нм ³ / с (преобразуется в M ^-1 с ^-1 с умножением на 0,602). Для реакций в 2D программное обеспечение определяет скорость 2D для двух интерфейсов на основе их скорости в 3D, деленной на шкалу длины, которая по умолчанию установлена ​​на 2σ (единицы нм), но может быть независимо задана для каждой реакции с помощью входного параметра.Реакция идентифицируется как 2D, если в ней участвуют два вида, которые не имеют диффузии в z (например, липиды), или между интерфейсами на двух комплексах, которые локализованы в 2D (D _z = 0). Для реакций самосвязывания и для реакций, в которых один реагент находится в 2D, мы вносим поправку на два множителя между макроскопическими и микроскопическими скоростями. Таблица в SI объясняет эти отношения. Вероятности каждой реакции рассчитываются с помощью метода FPR, как описано ранее, и параметризуются собственной скоростью реакции k _a , чистым коэффициентом диффузии реагентов D _до и радиусом связывания σ.Поддерживаются два типа бимолекулярных реакций:

1. Ассоциация: формирует взаимодействие между двумя поверхностями раздела двух молекул, которое, если ассоциация обратима, имеет сопряженную реакцию диссоциации первого порядка. Полученный комплекс затем рассматривается как единое целое для будущего распространения. Например. A (a) + B (b) → A (a! 1) .B (b! 1)

2. Изменение состояния: изменение состояния границы раздела на частице, чему способствует другая частица, например, фосфорилирование киназа.Таким образом, это реакция связывания, которая автоматически приводит к изменению состояния первого порядка на одной границе раздела, и оба реагента остаются несвязанными. Например. A (a) + B (b∼u) → A (a) + B (b∼p).

Связывание внутри комплекса

Важным следствием образования самосборок является то, что молекулы могут быть способны связываться друг с другом через свободные интерфейсы, когда они находятся в одном комплексе. Эти внутрикомплексные события связывания включают в себя два интерфейса, которые становятся связанным комплексом, но не являются по-настоящему бимолекулярными, поскольку они не включают поиск друг друга — они уже совместно локализованы.Таким образом, они являются мономолекулярными реакциями или реакциями первого порядка, и их нельзя рассматривать с той же вероятностью связывания, которая используется для бимолекулярных событий. Мы определяем вероятность связывания этих событий внутри комплекса или замыкания петли, таким образом, используя вероятность Пуассона, подобную реакциям порядка 1^{-го порядка} , описанным выше. Затем мы должны указать мономолекулярную скорость, учитывая бимолекулярную константу скорости. Мы определяем эту скорость так, чтобы равновесие между связанным и несвязанным состояниями для двухэтапного процесса закрытия петли, то есть бимолекулярного события и мономолекулярного замыкания петли, было таким же, как если бы белок замыкал петлю за один этап. , образуя сразу обе связи.Ставка рассчитывается по: где C ₀ — концентрация 1M в стандартном состоянии. Таким образом, для замыкания цикла пользователь может указать один дополнительный параметр Δ G _coop . Положительные значения этого параметра позволяют создавать более динамичные обратимые петли, которые в противном случае имеют тенденцию к высокой стабилизации по сравнению с одинарными связями. Мы выводим это выражение в СИ.

Мы позволяем этим событиям формироваться, когда интерфейсы пространственно близки, и пользователь может указать максимальное расстояние, на котором эти события могут произойти.Максимальное расстояние — это радиус привязки σ, умноженный на коэффициент bindRadSameCom, который по умолчанию имеет значение 1,01, что включает только идеально (с допустимыми ошибками числовой точности) выровненные контакты. Основная причина его увеличения заключается в том, что для некоторых самосборных конструкций (таких как изогнутый клатриновый каркас) жесткие конструкции не могут образовывать идеальные бездефектные структуры. Возможность связывания между ногами, которые находятся близко друг к другу, имитирует структурную гибкость, присутствующую в биологических молекулах.Наконец, программное обеспечение запрещает связывание между парой молекул, если они уже связаны через отдельный набор интерфейсов. Следовательно, внутрикомплексные события или события замыкания петли должны опосредоваться по крайней мере через третью молекулу (например, 4 молекулы в случае решеток клатрина).

Оценка стерического перекрытия

Как только события ассоциации происходят между двумя интерфейсами, их два родительских комплекса поворачиваются на свои места для создания правильной, заранее определенной геометрии двух связывающих белков.Исключением является связывание внутри комплекса, где, поскольку связывание происходит в пределах одного комплекса, вращения или движения не происходит. Для двух отдельных комплексов, однако, это вращение на месте может привести к стерическому перекрытию между интерфейсами, которые являются частью комплекса, но не частью события связывания. Мы оцениваем перекрытие после ассоциации, измеряя расстояния между всеми центрами масс в новом комплексе и определяя минимальное расстояние overlapSepLimit, которое будет определять стерическое перекрытие.Если какая-либо пара белков имеет COM меньше, чем overlapSepLimit, который по умолчанию равен 1 нм, событие связывания отклоняется, и два комплекса вместо этого претерпевают диффузионное движение во время временного шага.

Затем выполняется окончательная проверка стерического перекрытия между вновь связанным комплексом и всеми другими интерфейсами связывания комплексов, присутствующих в моделировании, чтобы гарантировать сохранение исключенного объема. Если новый комплекс вызывает стерические конфликты с другими интерфейсами привязки в томе моделирования, событие привязки отклоняется.

Граничные эффекты

По умолчанию границы моделирования отражают. Если события ассоциации приводят к очень большой решетке, структура может выходить за физические границы объема моделирования. Таким образом, эти ходы отклоняются. В связи с этим, если события ассоциации приводят к очень большой поворотной переориентации комплекса, эти перемещения также могут быть отклонены, поскольку они приводят к нефизической величине смещения за временной шаг.

Константы диффузии комплексов

Когда белки связываются с образованием нового комплекса, их константы трансляционной и вращательной диффузии обновляются, чтобы отразить больший гидродинамический радиус связанного комплекса.Каждая белковая молекула имеет определенные пользователем D _t и D _R . После образования связанного комплекса новые коэффициенты переноса определяются на основе всех N компонентов комплекса, просто принимая сумму радиусов: и то же самое в y и z. Для молекул, ограниченных поверхностью D _{t, z} = 0 и вся вращательная диффузия, кроме (если желательно) D _{R, z} также равны нулю. Соответственно, любой комплекс, содержащий эти молекулы, также будет иметь этот диффузионный компонент, установленный на ноль.

Вывод данных

NERDSS создает файлы перезапуска, которые гарантируют, что в случае прерывания моделирования по какой-либо причине их можно будет перезапустить точно с того места, где они были остановлены, аналогично программному обеспечению Molecular Dynamics. NERDSS также записывает несколько свойств системы во времени, включая координаты всех видов и распределение белков между различными типами комплексов.

Шаги алгоритма моделирования

• (i) Инициализация. Копии исходных частиц создаются из предоставленных шаблонов с заданными случайными координатами и проверяются на размещение в объеме моделирования и перекрытие с другими частицами.Перекрытие корректируется только в том случае, если два интерфейса, которые могут реагировать друг с другом, находятся в пределах радиуса связывания их реакции. Если обнаруживается, что две частицы перекрываются, одна из них повторно инициализируется с новыми случайными координатами, и все частицы повторно проверяются на перекрытие.

• (ii) Оптимизация. Чтобы оптимизировать оценку двухчастичных (бимолекулярных) событий, объем моделирования разделен на N суббоксов, где длина каждого края суббокса составляет не менее, где м проходит по всем реакциям связывания, σ — радиус связывания, D — общий коэффициент диффузии обоих реагентов, и l _im — радиус белка-реагента i .Молекулы назначаются ящикам в зависимости от положения их COM. Это позволяет обходить все возможные партнеры связывания только в текущих и соседних блоках молекулы, не исключая любых партнеров с ненулевой вероятностью реакции.

• (iii) Реакции. В пределах каждого временного шага вероятности реакции вычисляются в порядке от реакций нулевого, первого и второго порядка.

Для реакций нулевого порядка определяется количество молекул N для создания на этом этапе, а затем эти новые молекулы помещаются в объем моделирования случайным образом, гарантируя, что они не перекрываются с другими партнерами по связыванию.

Для реакций первого порядка каждая молекула проверяется на соответствие списку правил реакций на совместимость, то есть, находятся ли ее интерфейсы в правильном состоянии и есть ли у нее правильные связанные партнеры, а вероятность проверяется относительно единообразного случайного числа. Если реакция происходит, она выполняется немедленно, и молекула и ее поверхности раздела не могут иметь место в каких-либо дальнейших реакциях или диффузии в течение этого временного шага.

Для реакций второго порядка вероятности парных реакций вычисляются для каждой пары интерфейсов в пределах R _max друг от друга, которые свободны для связывания.Затем для каждой молекулы вероятности каждой из возможных реакций связывания на этом этапе сравниваются с однородным случайным числом. В случае возникновения реакции она выполняется немедленно. Для всех реакций, если молекула создается или участвует в реакции каким-либо образом, в том числе в качестве нереагирующего члена реагирующего комплекса, она не может участвовать ни в какой другой реакции в течение временного шага, а также не может диффундировать. . Однако другие распространяющиеся частицы будут включать их в проверки перекрытия.С другой стороны, если определено, что частица не участвует в реакции, для этого комплекса выбираются и сохраняются распределенные по Гауссу вращательные и поступательные векторы распространения.

• (iv) Распространение и перекрытие. После того, как все проверки реакции завершены, интерфейсы, которые находились в пределах R _max партнера по реакции во время временного шага, проверяются на перекрытие. Поскольку многокомпонентный комплекс движется только как жесткая единица, каждый комплекс с реактивными интерфейсами внутри зацикливается вместе с сохраненным списком всех партнеров по реакции.Если вновь смещенные позиции перекрываются (со смещениями, выбранными из гауссиан для поступательной и вращательной диффузии для обоих партнеров реакции), смещения комплекса i и его партнера повторно дискретизируются, и проверка перекрытия перезапускается. После обновления положения комплекса его нельзя будет снова переместить. Для очень загруженных моделей (здесь не изучаемых) эта попарная последовательная оценка перекрытия не может предотвратить все перекрытия. Таким образом, у нас есть другая версия оценки перекрытия, которая находит всех партнеров по реакции комплекса и , а также всех партнеров по реакции этих партнеров и т. Д., Чтобы создать кластер интерфейсов, позиции которых должны быть одновременно решены, чтобы предотвратить перекрытие.Эта версия с перекрытием кластеров может быть медленнее, и если решение не найдено за несколько итераций, она переходит к обновлению позиций, повторяя более мелкие шаги, пока не будет достигнут полный временной шаг.

Детали моделирования

Все моделирование проводилось на рабочих станциях Dell под управлением Linux с ядрами Intel (i7-8700, Xeon E5-2697v4, i9-9980XE) или MacBook Pro с Intel Core i7 7700HQ или суперкомпьютером MARCC на Университет Джона Хопкинса.

Моделирование Холкара

Экспериментальные данные любезно предоставлены профессором Пукадилом. На рисунке 2 мы показываем в среднем более 40 кинетических следов флуоресценции клатрина, накапливающихся на мембранах, предварительно уравновешенных придатками AP-2 β . Экспериментальные данные могут быть подогнаны, как и в исходной публикации ²⁹ , к экспоненте с запаздыванием: y ( t ) = b + H ( t — τ ) A [1 — exp (- k ( t — τ ))], где H — функция Хевисайда, τ — время запаздывания и k — скорость роста.Смещение b и плато A даны в произвольных единицах. Для усредненных данных мы нашли τ = 10,7 с и k ⁻¹ = 107 с. Подобные результаты получаются, если все 40 кривых подбираются независимо, а затем параметры усредняются. Данные моделирования были подобраны для той же функции, где лучшая смоделированная модель имела τ = 11 с и k ^-1 = 97 с. Остальные параметры: b = 54 и A = 2823 (количество копий / мкм ² ). Экспериментальные данные были нанесены на ту же ось ординат (т.е. в единицах количества копий, а не в произвольных единицах) путем обнуления смещения (вычтенного из 290) и масштабирования высоты на 1,6.

Экспериментальный V составляет 200 мк л, а экспериментальный A — 2,017 × 10 ⁸ мк м ² рассчитывается на основе 1 нмоль общего липида со средней SA липидов 0,67 нм ² и сформирован двухстворчатый бислой. Таким образом, экспериментальное отношение V / A составляет 991 мкм мкм. Моделирование NERDSS было выполнено в коробке, которая должна поддерживать такое же соотношение V / A.Мы определили коробку с площадью плоской поверхности (SA) 1 мкм м ² , для которой потребуется высота 991 мкм м. Таким образом, 80 нм клатрина в этом объеме равняются 47760 копий. Клатрин значительно превышает доступную площадь поверхности; если предположить, что каждый тример клатрина занимает около 201 нм ² пространства на поверхности, то на поверхности можно разместить максимально около 5000 нм. Чтобы избежать распространения тысяч растворов клатрина, мы вместо этого установили моделирование с высотой 1 мкм м и поддерживали постоянную (стохастически флуктуирующую) концентрацию [Cla] _до = 80 нМ (48 копий) в растворе.Таким образом, предполагается, что общая концентрация клатрина в растворе не изменяется по мере того, как клатрин накапливается на мембране, что верно с очень хорошим приближением (общее количество копий раствора упадет с 80 нМ до 77 нМ за 100 с). Это было сделано с помощью реакции нулевого порядка с образованием клатрина при k _create = [Cla] _до D _{Cla /} z ² , чтобы аппроксимировать временные масштабы диффузионного потока через элементы объема высота z, и разложив раствор клатрина со скоростью k _{, уничтожьте} = D _Cla / z ² , где D _Cla установлен на 13 μ м ² / с.Клатрин на мембране не подвержен реакции разложения. D _R = 0,03 рад ² / с. Был использован шаг по времени 3 мкм с.

Из липидов на поверхности только 5 мол.% Были липидами, хелатирующими никель (0,0746 / нм ² ), которые могли связываться с His-меченными адапторными белками. Однако сродство между His-меткой и липидом-хелатором достаточно слабое ⁴⁵ , поэтому мы ожидаем, что только часть этих липидов-хелаторов связывается с адаптерами (первоначально присутствующими при 200 нМ).Для K _D в диапазоне от 1 до 10 мк M между хелатором и His-тегом у нас будет ∼1400-12000 адаптеров на поверхности до того, как клатрин поступит внутрь. Таким образом, мы рассматриваем это как параметр в модели. оптимизация, с моделями, которые лучше всего описывают эксперимент, содержащий от 6000 до 9000 адаптеров на поверхности. Модель на рис. 2 имеет N = 7000 адаптеров, прикрепленных к поверхности.

Эти симуляции были начаты с нулевым клатрином, но создание привело к установившейся концентрации 80 нМ на ∼0.2с. Таким образом, задержка в ~ 10 с происходит не из-за диффузии на поверхность, а из-за медленного связывания клатрина с адаптерами, связанными с мембраной. Это согласуется с экспериментальными данными ²⁹ о том, что другой адаптер образовал ядро ​​клатрина на мембране с гораздо более коротким временем задержки ~ 1 с, предположительно из-за более быстрого связывания клатрина с этим адаптерным белком.

Сила взаимодействия клатрин-клатрин была установлена ​​равной 120 мк M ⁴² со скоростью отклонения 10 с ^-1 .Кооперативность была введена для взаимодействий клатрин-клатрин на основе того, был ли клатрин связан с адаптером; если тример связывался с адаптером, его аффинность связывания с другими тримерами клатрина увеличивалась по другим его сайтам связывания клатрина за счет увеличения скорости включения в 15 раз, при сохранении той же скорости отклонения. Связывание между клатрином и адаптерным белком было постоянным и составляло 25 мк М, аналогично биохимическим измерениям ⁴⁶ , с медленной скоростью 4000 М ^-1 с ^-1 .

Моделирование проводилось путем обработки участков связывания адаптера на поверхности с использованием нашей модели неявных липидов для ускорения моделирования ³⁶ . Эта модель, как было показано, точно воспроизводит кинетику связывания с явными поверхностными сайтами в 3D и 2D ³⁶ . Важно отметить, что он фиксирует 2D-связывающие взаимодействия между клатрином, которые уже локализованы на поверхности через один адаптер, но имеют 2 дополнительных сайта связывания, доступных для связывания других адаптеров. Все скорости связывания в 2D были определены на основе их соответствующих скоростей в 3D с коэффициентом преобразования длины 30 нм ¹⁸ .Эта шкала длины применима как к взаимодействиям клатрин-адаптер в 2D, так и к взаимодействиям клатрин-клатрин в 2D. Коэффициент кооперативности клатриновой петли был установлен равным f = 0,001 ( f = exp [-ΔG _coop / k _B T]).

Моделирование сборки клатрина в растворе

Для рисунка 3 все моделирования были выполнены с использованием 100 тримеров клатрина в коробке длиной 0,494 мкм м на каждую сторону. Коэффициенты отклонения для всех систем были установлены на 1 с ^-1 для всех взаимодействий.K _D : 100 мкм, M или 0,2 мкм, M, с соответствующими входными скоростями. Шаг по времени составлял 0,2 мкм с, и на рис. S3 мы проверяем ту же кинетику с меньшим шагом по времени. Коэффициент кооперативности петли был установлен на f = 0,001, что делает свободную энергию связывания примерно в 1,5 раза сильнее, чем единичное событие связывания, что делает возможным более обратимые события образования петли. На рис. S4 мы показываем, как это влияет на кинетику и равновесие. Для кооперативного моделирования соотношение между двумя клатринами увеличивается в 10 раз, если один из клатринов не является мономером, а затем увеличивается еще в 10 раз, если оба клатрина являются немономерными.В данном случае плоские молекулы клатрина имеют длину ветви 10 нм, так что расстояние между двумя центрами связанного димера составляет 21 нм (включая радиус связывания σ = 1 нм). Константы диффузии клатрина были определены на основе его размера как D _t = 13 мкм м ² / с и D _R = 0,03 рад ² / с, предположительно изотропные. Для сморщенного клатрина длина ножек была установлена ​​равной 7,5 нм, а ножки были смещены от плоскости на 10 градусов. Для моделирования сморщенного клатрина, поскольку на решетке могут образовываться дефекты, мы позволили образоваться связыванию (например,грамм. чтобы закрыть шестиугольник), когда сайты связывания находились на расстоянии 5 нм. Идеальный контакт происходит только в плоской решетке, где все тримеры клатрина выравниваются для контакта на радиусе связывания σ = 1 нм.

Временные графики и сложные гистограммы усредняются по 3-5 независимым траекториям. Показанные гистограммы взяты из последних шагов моделирования, хотя они напечатаны повсюду.

Сборка и разборка решетки при моделировании мембран

Моделирование из рисунка 4 включало 100 тримеров клатрина, 300 адаптерных белков, 6000 начальных копий PI (4,5) P ₂ на поверхности и 10 копий синаптоянина фосфатазы в коробка размером [0.7, 0,7, 0,494] мкм мкм. Шаг по времени составил 0,2 мкм с. Константы равновесия для связывания соответствовали литературным наблюдениям, но они не были зафиксированы моделью, описывающей эксперимент на рис. 2. Взаимодействия клатрин-клатрин были установлены на уровне 110 мк M, с отклонением 10 с ^-1 в все модели. Кооперативность, управляемая адаптером, не была включена, чтобы изолировать роль 2D-локализации в приводном узле ¹⁸ . Взаимодействия клатрин-адаптер имели относительно высокую скорость, равную 6 × 10 ⁶ M ^-1 с ^-1 , и либо 1 с ^-1 , либо 10 с ^-1 .Привязка адаптера к PI (4,5) P ₂ также имела скорость включения 6 × 10 ⁶ M ⁻¹ s ⁻¹ и либо 1s ⁻¹ , либо 10s ^−1. со скидкой. Связывание синаптоянина с адаптерным белком составляло 6 × 10 ⁵ M ^-1 с ^-1 и скорость отклонения 1 с ^-1 во всех моделях. Наконец, синаптоянин связался с PI (4,5) P ₂ со скоростью 2,5 × 10 ⁷ M ^-1 с ^-1 , за исключением моделирования «без активности», где он был установить на ноль.Связывание немедленно приводит к дефосфорилированию PI (4,5) P ₂ и высвобождению синаптоянина, чтобы снова действовать на другой липид. Липид PI (4,5) P ₂ имеет только один сайт связывания, что означает, что если он связан с адаптерным белком, на него не может воздействовать синаптоянин. Адаптерные белки не могут связываться с дефосфорилированным липидом PI (4) P.

Константы диффузии установлены на D _cla = 13 μ м ² / с, D _{R, cla} = 0.03 рад ² / с. D _ap = 25 мкм м ² / с, D _{R, ap} = 0,5 рад ² / с. D _pip = 1 μ m ² / s ( D _{z, pip} = 0), D _{R, pip} = 0. D _синх. = 25 мкм м ² / с, D _{R, синх.} = 0,5 рад ² / с.

Для всех двухмерных взаимодействий связывания, где скорости и K _D s имеют единицы на площадь (а не на объем), мы присвоили скорости, основанные на делении k _{a, 3D} (скорость реакции) на 2σ и оставив без изменений k _b (списание).Коэффициент кооперативности петли (применяется только к взаимодействиям клатрин-клатрин) был установлен на f = 0,001.

Моделирование сборки мономера Gag

Моделирование Gag проводилось в коробке размером [1, 1, 1] мкм м. Был использован временной шаг 0,1 мкм с. Скорость гомодимеризации была установлена ​​равной 3 × 10 ⁶ M ^-1 с ^-1 со скоростью отклонения 1 с ^-1 . Скорость гетеродимеризации (G1 + G2) в 10 раз ниже, при 3 × 10 ⁵ M ^-1 с ^-1 , с той же скоростью 1 с ^-1 .Коэффициенты переноса были установлены на D _t = 10 μ м ² / с и D _R = 0,05 рад ² / с. Мономеры Gag титруются в систему со скоростью 3,3 × 10 ⁵ M ^-1 с ^-1 , или в два раза быстрее. Мономеры (только полностью несвязанный Gag) разлагаются со скоростью 1 с ^-1 . Следовательно, Gag, который образовал димер или комплекс более высокого порядка, защищен от деградации. Коэффициент кооперативности контура был установлен равным f = 0.001. Белки Gag, которые находились в одном комплексе, могли связываться друг с другом (например, закрывать гексамер), даже если они не были идеально выровнены, в пределах расстояния 1,5 нм (идеальный контакт находится при радиусе связывания σ = 1,0 нм).

Моделирование модели тактового генератора

Смоделированная здесь модель циркадных часов взята непосредственно из опубликованной модели ³¹ 2002 года, которая с тех пор широко изучается. Отметим здесь изменения, внесенные в NERDSS. Единицы всех скоростей были изменены с ^-1 на ^-1 , потому что разрешение всех коллизий в многочасовой шкале времени слишком дорого.Все 6 частиц в системе являются точечными частицами с константой диффузии D _t = 10 μ m ² / с. Моделирование было начато с одной копии каждого из PrmR и PrmA. Все реакции создания и разложения имели те же значения, что и опубликованные. Поскольку события бимолекулярной ассоциации были ограничены диффузией между A и обоими генами (PrmR и PrmA) (6,02 x10 ⁸ M ^-1 с ^-1 ) и между A и R (1,204 x10 ⁹ M ^{— 1} s ^-1 ), радиус связывания σ для этих реакций имел минимальный размер> 1 нм, что указывает на эффективно более длинный масштаб длины, на котором эти молекулы могут найти друг друга.Для A + PmrR мы полагаем σ = 5nm, а для A + R мы полагаем σ = 8nm. Этот радиус также устанавливает исключенный объем каждой из этих пар молекул относительно друг друга. Когда РНК или белок создаются, они помещаются на расстоянии σ = 5 нм от их молекулы-создателя, чтобы минимизировать возможное перекрытие в последующих событиях создания. Был использован временной шаг 10 или 50 мкм с, что дало тот же результат.

Для событий обратимой бимолекулярной ассоциации в NERDSS мы должны определить внутренние скорости k _a и k _b так, чтобы ¹² , где макроскопические скорости k _PB 3 и 44 k Pvv — это значения, определенные в модели выше и используемые в PDE и алгоритме непространственного стохастического моделирования.Единственным исключением является событие A + R → A.R, которое необратимо. Внутренняя скорость k _a по-прежнему определяется стандартным способом, учитывая макроскопическую действующую скорость ¹² .